流式细胞仪检测细胞凋亡：Heochst 33342/PI双染色法

细胞

Heochst 33342 染液  PBS  蒸馏水

400目筛网  流式细胞仪  冰箱

一、细胞培养

悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ，终浓度为1 ug/ml； 37℃孵育7-10 min。

二、细胞收集

低温500 ~ 1 000 r/min离心5min弃去染液。

三、染色

加入1.0 ml PI染液，4℃避光染色15 min。

四、过滤

400目的筛网过滤1次。

五、流式细胞仪分析

Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352 nm，发射光波波长为400 ~ 500 nm，产生兰色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488 nm，发射光波波长大于630 nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。

六、结果判断

在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。

1.  在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。

2.  用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20 min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。